Генетик тикшеренүләр үткәргәндә, без еш кына РНК үрнәкләрен очратабыз, мәсәлән, кечкенә анатомик авыз шешләрен, хәтта бер күзәнәкле үрнәкләрне, һәм кеше күзәнәкләрендә бик түбән дәрәҗәдә транскрипцияләнгән махсус ген мутацияләрен өйрәнү өчен.Әлбәттә, COVID-19 тесты өчен, әгәр дә караклар тиешле урында булмаса яки үрнәк алу вакытында җитәрлек булмаса, үрнәк күләме бик түбән булачак, шуңа күрә Сәламәтлек һәм Гаилә планлаштыру комиссиясе ике көн элек чыккан һәм сынауны үтте, ә нуклеин кислотасы үрнәге алты үрнәк алмаса, сез моны хәбәр итә аласыз.
Реагентның сизгерлеге мөһим, чөнки бездә бу проблема яки теге проблема бар, шуңа күрә без RT-PCR сизгерлеген яхшырту өчен нәрсә эшли алабыз?
Мөмкин булган чишелешләр турында сөйләшкәнче, әйдәгез искә төшергән ситуация белән ике зур кыенлыкны искә төшерик.
Беренчедән, безнең үрнәктә берничә күзәнәк популяциясе булганда, РНК югалуы турында борчылабыз.Әгәр традицион аеру һәм чистарту ысуллары кулланылса, багана ысулы яки нуклеин кислотасы явым-төшем ысулы кебек, берничә үрнәкнең юкка чыгу ихтималы зур.Бер чишелеш - tRNA кебек ташучы молекуласын өстәү, ләкин ул вакытта да безнең торгызу эксперименты әйбәт булуына гарантия юк.
Яхшырак юл нинди?Мәдәниятле күзәнәкләр яки микроанатомик үрнәкләр өчен яхшы вариант - туры лизис куллану.
Идея - күзәнәкләрне 5 минутка бүлү, РНКны эремәгә җибәрү, аннары реакцияне 2 минутка туктату, аннары лизатны кире транскрипция реакциясенә өстәү, РНК юкка чыкмасын, һәм ниһаять, килеп чыккан cDNAны туры кую. реаль вакыт реакциясенә.
Ләкин, башлангыч нокта чикләнгән яки аз күләмле ген экспрессиясе аркасында, без барлык РНКны эшкәртә алабыз һәм яхшы реаль вакыт сигналын алу өчен җитәрлек шаблоннар белән тәэмин итмибез икән?
Бу очракта көчәйтү алдыннан адым бик файдалы булырга мөмкин.
Түбән транскрипциядән соң сизгерлекне арттыру схемасы.Башлау алдыннан, без нинди максатлар белән кызыксынганыбызны түбән агымнан сорарга тиеш, шулай итеп көчәйтү алдыннан бу максатлар өчен махсус праймериз эшләргә.
Бу 100 пар пар пример һәм 10 - 14 тапкыр реакция циклы катнаш пример ясап ирешеп була.Шуңа күрә, бу таләп өчен махсус эшләнгән Master Mix алынган CDNA-ны алдан көчәйтү өчен кирәк.
10 белән 14 арасында цикл санын билгеләү сәбәбе - бу чикләнгән цикл төрле максатлар арасындагы очраклылыкны тәэмин итә, бу санлы молекуляр мәгълүматка мохтаҗ тикшерүчеләр өчен бик мөһим.
Алдан көчәйтүдән соң, без күп күләмдә cDNA ала алабыз, шулай итеп арткы очтагы ачыклау сизгерлеге яхшыра, һәм без хәтта үрнәкне эретеп, мөмкин булган очраклы хаталарны бетерү өчен реаль вакыттагы PCR реакцияләрен ясый алабыз.
Пост вакыты: 11-2023 апрель